Infection par herpèsvirus humain après transplantation de cellules souches autologues ou allogéniques: étude longitudinale prospective monocentrique de patients

Pour déterminer l’incidence et la pertinence clinique de l’herpèsvirus humain HHV-infection active, des receveurs consécutifs non sélectionnés de greffes de cellules souches autologues ou allogéniques ont été étudiés dans une étude longitudinale prospective. L’infection active a été évaluée par la présence d’ADN viral désoxyribonucléique dans des échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique. et spécimens de plasma, au moyen d’une réaction en chaîne par polymérase spécialement conçue pour éviter la détection du génome latent. L’incidence de l’infection à HHV observée était de%, quel que soit le type ou la source de greffe. myélosuppression P = et fièvre P & lt; L’infusion de moelle osseuse comme source de greffe, la réactivation survenant avant la prise de plaquettes ou la prise de neutrophiles et la présence d’ADN HHV dans le plasma ont été identifiées comme des facteurs de risque d’infection symptomatique à HHV P & lt;

L’allotransplantation et la greffe autologue de moelle osseuse ou, plus récemment, de cellules souches du sang périphérique sont couramment utilisées pour traiter de nombreux troubles hématopoïétiques ou lymphoïdes Les infections virales, notamment celles provoquées par les herpèsvirus tels que le cytomégalovirus CMV, représentent une cause majeure de morbidité , surtout après transplantation allogénique, mais peuvent également affecter les receveurs autologues. Au cours des dernières années, la pathogénicité potentielle de l’herpèsvirus humain HHV-, qui appartient à la même sous-famille que le CMV, a commencé à être explorée chez les patients transplantés. Des corrélations cliniques ont été étudiées chez un nombre limité de patients, principalement chez des receveurs de greffe allogénique de moelle osseuse. Chez ces patients, le HHV- a été associé à plusieurs des événements suivants: éruptions cutanées, fièvre, pneumonie interstitielle, retard ou suppression de myeloengraftment, myelosuppression se produisant après la greffe, encéphal Cependant, la plupart de ces études ont donné des résultats contradictoires. Cela peut être dû aux différentes méthodes utilisées pour déterminer la présence d’une infection active. l’infection active peut être diagnostiquée, l’isolement dans les cultures cellulaires prend des jours et peut être trop difficile et coûteux pour une utilisation de routine La sérologie est d’utilisation limitée dans le contexte de l’immunosuppression La détection de l’ADN HHV, par PCR, dans le sang périphérique semblent donc être le test de laboratoire le plus prometteur, car il est facilement adaptable à l’utilisation courante en laboratoire. Cependant, les procédures techniques doivent être ajustées pour permettre une discrimination suffisante entre infection latente et active. Cette étude longitudinale prospective de patients non sélectionnés consécutifs évaluer l’incidence et la pertinence clinique de l’infection à HHV active, évaluée par la présence d’ADN viral dans le mononucléide du sang périphérique cellules PBMC ou plasma, après transplantation de cellules souches autologues ou allogéniques

Patients et méthodes

Patients et plan d’étude De janvier à janvier, des patients consécutifs et non sélectionnés, en cours de transplantation de cellules souches au CHU de Nantes, ont été inclus dans cette étude longitudinale prospective.

Caractéristiques de patients recevant une greffe allogénique ou autologue de cellules souches Les patients ont été examinés pour une infection à HHV active une fois pendant les jours précédant la transplantation et une fois par semaine ou deux fois par mois au cours de la première transplantation de cellules souches allogéniques ou autologues. jours après la transplantation après la procédure, la période de suivi allait de quelques jours à plusieurs jours; médiane, jours À chaque point de suivi, les PBMC ont été testés pour la présence d’ADN HHV- Si des échantillons PBMC consécutifs se sont révélés positifs par PCR, des échantillons plasmatiques ont également été testés pour le HHV-DNADur la période de suivi, le les symptômes suivants potentiellement liés à HHV ont également été notés par un médecin ne connaissant pas les données du test HHV: température de fièvre isolée> 0 ° C pendant au moins jours sans résultats microbiologiques positifs documentés dans les échantillons de tout site corporel; éruption cutanée en l’absence de GVHD confirmée; thrombocytopénie numération plaquettaire, & lt; × cellules / L, leucopénie, nombre de leucocytes, & lt; × cellules / L, ou niveau d’hémoglobine d’anémie, & lt; g / L après la prise de greffe; pneumonie avec microbiologie négative sur lavage broncho-alvéolaire; et la participation au SNC La prophylaxie par la GHVHD consistait en la combinaison standard de cyclosporine A et de méthotrexate; GVHD active a été traitée avec des stéroïdes mg / kg / jour Le traitement antiviral consistait en acyclovir administré soit pour la réactivation du virus herpès simplex mg / kg / jour ou en prophylaxie du CMV chez les receveurs allogéniques séropositifs pour le CMV mg / m tid Ganciclovir mg / kg soumission pour – semaines a été commencé après le deuxième résultat positif de test de l’ADNmc du CMV Définitions “L’infection HHV active” a été définie comme la présence de l’ADN HHV dans PBMC “Greffe de neutrophiles” a été définie comme un nombre absolu de neutrophiles de & gt; × cellules / L, et “prise de plaquettes” a été défini comme un nombre de plaquettes de & gt; × cellules / L pendant des jours consécutifs, en l’absence de transfusion plaquettaire GVHD a été diagnostiquée et évaluée selon la lésion d’organe et a été confirmée par biopsie Sérologie des receveurs HHV- a été déterminée pendant la prétransplantation au moyen de ELISA HHV-IgG EIA ; Biotrin, Dublin effectué selon les recommandations du fabricant Le statut immunologique pour le CMV, le virus d’Epstein-Barr et le virus de l’herpès simplex a été évalué en utilisant les tests courants dans notre laboratoire enzymatique alpha Enzygnost; Dade-Behring, Francfort, AllemagneHHV- Détection et typage de l’ADN Pour éviter les résultats faussement positifs causés par la contamination de l’ADN, des procédures expérimentales rigoureuses, y compris l’utilisation de salles séparées pour la manipulation d’échantillons d’ADN, la préparation d’aliquotes du mélange PCR, l’analyse des produits de PCR, on a observé que l’ADN a été extrait des PBMC et que le plasma obtenu à partir d’échantillons de sang anticoagulés EDTA a été recueilli au moyen d’une centrifugation en gradient de densité Ficoll-hypaque; Eurobio, Les Ullis, France, ont été comptés, et ont été remis en suspension dans du PBS à la concentration ajustée de × PBMC / mL. L’ADN a ensuite été extrait au moyen d’une technique rapide de décongélation-ébullition. tampon de lyse mM Tris mM EDTA% protéinase K et% SDS à ° ​​C pour h, et la protéinase K a ensuite été inactivée à ° C pendant min. Toutes les amplifications ont été effectuées sur les surnageantsHHV- DNA des deux variants a été amplifié par PCR avec des amorces consensus. les produits amplifiés ont ensuite été développés et typés au moyen d’une hybridation oligonucléotidique spécifique aux variants. Les séquences d’amorces et de sondes, localisées dans le gène de la protéine tégumentaire du génome HHV, ont été adaptées à partir de données précédemment publiées. ° C, s à ° C, et s à ° C sur μL d’extrait d’ADN dans μL de mélange mM MgCl, μM de chaque dNTP, mM de chaque amorce P et P, et U de Taq polymérase L’hybridation de plaque colorimétrique a été réalisée à l’aide de un ADN EIA GEN-ETIK-DEIA; DiaSorin, Saluggia, Italie, comme décrit précédemment Les hybridations ont été effectuées à ° C avec ng de chaque sonde sondes PA et PB par mL Deux extraits d’ADN contrôles positifs correspondant à la souche variante A TAN et à la souche variante H HST; donnés par JT Aubin, Laboratoire de Virologie, Hopital Pitié-Salpétrière, Paris et un témoin négatif eau stérile ont été systématiquement inclus dans chaque ensemble de procédures d’amplification

Tableau View largeTélécharger slideOligonucléotides utilisés pour l’amplification de l’herpèsvirus humain et typingTable View largeDownload slideOligonucléotides utilisés pour l’amplification et le typage de l’herpèsvirus humainLa spécificité de l’amplification a été évaluée par l’absence de détection d’autres herpèsvirus Amplifications des dilutions en série des contrôles positifs, en utilisant notre propre procédure et la PCR d’amorce spécifique aux variants décrite par Aubin et al , a donné le même seuil de détection TCID , – à – Échantillons Un total d’échantillons de sang traités à l’EDTA ont été collectés pour le test HHV-ADN dans les PBMC. Les échantillons ont été analysés pour chaque patient. Les échantillons ont été analysés pour chaque patient. Des échantillons de plasma et de médium ont été prélevés en même temps que des échantillons positifs de PBMC. prévalence de l’ADN HHV dans un contexte immunocompétent pour isoler HHV- de la peau a été faite pour les patients avec une éruption cutanée Analyse statistique Les données ont été analysées en utilisant la base de données informatique Epi Info, version b Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta analyse univariée a été faite en utilisant soit le test or ou le Test exact de Fisher, pour la proportion, et soit le test F ou le test non paramétrique de Kruskal-Wallis, pour l’analyse de variance des moyennes Les facteurs de risque biologiques et cliniques plausibles pour l’infection HHV ont également été évalués par analyse de régression logistique; les facteurs significatifs à P = ont été conservés dans le modèle EGRET; Recherche statistique et épidémiologique, Seattle Dans tous les cas, l’IC était%; valeurs de P & lt; ont été considérés comme significatifs

Résultats

Données virologiques pendant l’infection par le HHV active Des échantillons de PBMC analysés pour l’ADN HHV provenant de receveurs d’autologues et de receveurs de greffe de cellules souches allogéniques,% de receveurs d’autologues et de receveurs de transplantations de cellules souches allogéniques ont donné des résultats positifs Toutes les souches HHV- L’incidence de l’infection à HHV active était de%, après transplantation autologue / patiente et allogénique / patiente Aucune différence significative n’a été notée en ce qui concerne la source de cellules souches de moelle osseuse vs les cellules souches du sang périphérique ou la prétransplantation HHV- sérostatusAmong Chez les patients atteints d’une infection à HHV active, le début de cette infection est survenu plusieurs jours après la transplantation. médiane, jours Le premier résultat PCR positif a été observé plus tôt chez les patients recevant des greffes autologues que chez ceux recevant des receveurs allogéniques. résultat de PCR positif unique isolé sur PBMC, et l’infection active a commencé plus tard après la transplantation. P = Pour les patients infectés restants allogéniques et receveurs de greffe autologue, la durée médiane de l’infection active était de plusieurs jours, jours; les patients étaient encore positifs à la fin de l’étude et n’ont eu que des épisodes sporadiques positifs à la PCR Parmi les patients dont le plasma a également été examiné pour l’ADN HHV, le% s’est avéré positif: la PCR a donné des résultats positifs. de l’ADNémie plasmatique a coïncidé avec le premier résultat PCR positif pour le délai médian des PBMC, jours; intervalle, – jours Aucun des échantillons de PBMC obtenus de personnes en bonne santé ou de patients avant la transplantation n’était positif pour l’ADN HHV

Tableau View largeTélécharger les lamesCaractéristiques virologiques des receveurs de greffe de cellules souches allogéniques ou autologues infectés par l’herpèsvirus humain HHV-Table View largeTélécharger slideCaractéristiques virologiques des receveurs de greffe de cellules souches allogéniques ou autologues infectées par l’herpèsvirus humain HHV-HHV-: associations cliniques et biologiques Pour l’évaluation du les conséquences d’une infection à HHV active, la survenue de symptômes présumés être liés à HHV- a été comparée chez des patients infectés pendant la période de PCR positive pour les PBMC et les sujets non infectés.

Table View largeTélécharger des manifestations cliniques et biologiques potentiellement associées à l’herpèsvirus humain actif HHV-infectionTable View largeTélécharger les lamesLes manifestations cliniques et biologiques potentiellement associées à l’herpèsvirus humain actif HHV-infectionLes symptômes les plus évocateurs de l’infection par HHV étaient l’hyperthermie et / ou la thrombocytopénie et / ou l’anémie. valeur prédictive de l’analyse PCR des PBMC pour la survenue de ces événements était toujours & gt ;, et il atteint lorsque tous les symptômes ont été observés ensemble Valeurs prédictives positives de l’apparition de la fièvre, l’anémie ou la thrombocytopénie étaient, et, et étaient, et, respectivement, après élimination des résultats de PCR positifs isolés, et ils sont tombés à & lt; si & gt; de ces événements sont survenus Les patients qui ont présenté une pancytopénie après la greffe étaient tous infectés activement. Les neutrophiles retardés et la prise de plaquettes ont été notées dans le groupe de patients infectés. En outre, chez les patients ayant développé une infection active avant greffe, la durée médiane de l’aplasie neutrophilique chez les patients et l’aplasie plaquettaire chez les patients, y compris chez les patients ayant un retard la prise de neutrophiles était significativement plus longue pour les neutrophiles: durée médiane, jours [intervalle, – jours]; pour les plaquettes: durée médiane, jours [intervalle, – jours] que chez les patients qui ont développé une infection active après la prise de greffe de neutrophiles: durée médiane, jours [extrêmes, – jours]; pour les plaquettes: durée médiane, jours [intervalle, – jours] ou chez ceux qui ne sont pas infectés activement P & lt; Encore une fois, aucune différence n’a été notée en ce qui concerne le type ou la source de greffe. Dans l’ensemble de la population infectée, nous n’avons observé aucune association significative avec les éruptions cutanées ou les signes pulmonaires. L’incidence de GVHD aiguë chez les greffés allogéniques corrélé avec l’infection par le HHV actif, qui a eu lieu chez les patients avec un grade GVHD ⩾ par rapport aux patients sans GVHD P & gt; Cependant, l’incidence de l’infection par le HHV était plus élevée chez les patients ayant développé une GVHD aiguë sévère. Among: Parmi les patients atteints de GVHD sévère, ils ont été déterminés positifs au HHV par analyse PCR, alors que parmi les patients avec GVHD non sévère, avait une infection active P = HHV- infection survenait avant la GVHD chez les patients, après GVHD chez les autres patients, et concomitamment chez le patient CMV infection active développée chez les receveurs de greffe de cellules souches allogéniques séropositives pour le CMV Ces patients étaient les seuls à avoir une infection à HHV active. Au début du traitement préventif par le ganciclovir, les résultats de la PCR pour HHV- étaient négatifs chez les patients. Chez le patient restant, l’ADN HHV a été éliminé du plasma mais pas des PBMC au cours du traitement. administration de ganciclovir Facteurs pronostiques Les variables suivantes ont été considérées comme des facteurs de risque biologiquement ou cliniquement plausibles pour l’événement ont été évaluées selon un modèle de régression logistique: sexe, âge, type et origine de la greffe, maladie sous-jacente, régime de conditionnement, et virus HHV-, CMV, Epstein-Barr et virus de l’herpès simplex du receveur. Au cours de l’infection active, des facteurs associés ont été identifiés L’infusion de moelle osseuse comme source de greffe était associée, chez tous les patients, à une hyperthermie au cours de l’infection P = Thrombocytopénie et / ou l’anémie, indépendamment de si elles ont été associées à la fièvre, sont également survenues plus fréquemment P & lt; ; RR, [% CI, -] pour la thrombocytopénie et [% CI, -] pour l’anémie Il n’y avait pas de différence entre ces transplantations allogéniques et autologues. En outre, la détection de l’ADN HHV dans le plasma était plus fréquemment associée à une thrombocytopénie seulement. = ou avec une thrombocytopénie et de la fièvre P = Les valeurs prédictives positives pour la PCR sur le plasma étaient par conséquent plus élevées que celles pour la PCR sur les PBMC, atteignant et, respectivement, pour la fièvre et la thrombocytopénie

Discussion

transplants em cell La durée médiane des jours d’infection active était plus longue que celle qui a été précédemment rapportée dans les études utilisant des méthodes de culture pour évaluer ce point particulier et elle n’a été significativement affectée par aucun des paramètres évalués dans notre étude. – Comme l’a déjà décrit une vaste étude épidémiologique sur des sujets immunocompétents examinés dans , nous avons observé dans notre population une baisse de la séroprévalence avec l’âge. Cela peut refléter une perte de spécificité. anticorps anti-HHV, devenus indétectables avec les tests sérologiques actuels Par conséquent, nous postulons que le sérotype HHV du receveur ne permet pas de distinguer la réactivation de l’infection primaire, en particulier dans ce contexte d’immunosuppression. observé chez les patients inscrits reste incertain en raison de la faible incidence Cependant, nous avons montré que la découverte d’au moins des résultats de PCR positifs consécutifs augmente leur valeur prédictive pour l’apparition de symptômes liés à HHV-, comme précédemment observé pour le CMV dans la greffe de moelle osseuse Il est particulièrement difficile de comparer nos données cliniques et de laboratoire avec celles d’autres séries publiées, qui ont produit des résultats quelque peu contradictoires La plupart de ces séries impliquaient un plus petit nombre de patients, dont certains étaient sélectionnés sur la base du statut sérologique CMV , d’une fièvre inexpliquée , ou suppression de la moelle osseuse Dans les études de patients moins nombreux ou non sélectionnés, une infection active a été diagnostiquée au moyen de divers outils, et les événements cliniques et de laboratoire analysés n’étaient pas homogènes en raison d’une grande disparité entre les doses utilisées pour l’administration d’acyclovir pendant notre étude et le petit nombre de patients recevant du ganciclovir, aucune information sur leur effet sur le HHV- Notre étude met en évidence l’association fréquente d’infection active avec fièvre et de myélosuppression partielle ou totale, quel que soit le contexte allogénique ou autologue. Nous avons trouvé plus de suppression des lignées érythroïdes et mégacaryocytaires, ce qui corrèle bien avec certaines études in vitro La contribution de l’infection à HHV active à GVHD est encore controversée [,,] Nous avons observé une sévérité accrue de GVHD chez les patients infectés [,,], mais nous n’avons pas pu déduire de notre étude aucun argument pouvant déterminer si l’infection HHV active améliore GVHD ou si elle est la conséquence de la thérapie GVHD Enfin, nous avons observé, comme observé précédemment chez les receveurs de transplantation d’organes solides , une relation entre l’infection active HHV et le développement subséquent d’une infection CMV active chez une souche séropositive allogénique. Les receveurs de greffe de cellulesInfusion de la moelle osseuse, qui était parmi les facteurs qui pourraient favoriser la maladie HHV présumée pendant l’activité Nous avons également montré que l’apparition précoce de l’infection, en particulier avant la prise de neutrophiles ou la prise de plaquettes, augmentait la sévérité des symptômes pouvant être attribués à HHV-, car la majorité des signes pulmonaires non diagnostiqués ou Des éruptions cutanées ont été observées durant cette période. Enfin, nous avons trouvé qu’un résultat PCR positif pour le plasma est le marqueur le plus spécifique de la survenue de thrombocytopénie et / ou de fièvre, bien que moins sensible. Ce marqueur a déjà été proposé pour le diagnostic sélectif d’infection active dans les études impliquant un nombre limité de patients et, potentiellement, comme précédemment démontré pour le CMV , comme marqueur de la maladie HHV- La présence d’ADN HHV dans le plasma peut probablement refléter une charge virale plus élevée, mais si l’ADN HHV plasmatique provient de la lyse des lymphocytes infectés par la réponse immunitaire reste flou, parce que l’incidence des résultats positifs de la PCR pour le plasma wa Les résultats de cette étude longitudinale prospective, réalisée sur un grand nombre de patients, montrent que l’adaptation des procédures techniques à la PCR peut permettre la détection de véritables infections actives. Sans mortalité ni événements cliniques sévères L’infection active pourrait entraîner une augmentation de la morbidité chez les receveurs de greffe de moelle osseuse allogénique et autologue et de cellules souches du sang périphérique, en particulier en raison de son effet myélosuppresseur. Une évaluation prospective dans des études multicentriques est maintenant nécessaire pour confirmer notre hypothèse. d’évaluer les avantages potentiels du traitement de l’infection active, en particulier chez les patients présentant un risque accru de maladie à HHV, tels que ceux pour qui la moelle osseuse était la source de cellules souches, ceux chez qui une réactivation précoce a eu lieu avant la transplantation ou ceux chez qui l’ADN HHV est présent dans un échantillon de plasma s